При производстве лимонной кислоты применяются три способа ферментации: 1) культивирование продуцента на поверхности твердой питательной среды (твердофазная ферментация); 2) поверхностное культивирование на жидкой среде; 3) погруженное глубинное культивирование.
Культивирование на поверхности твердой среды. Гриб-продуцент {A. niger) выращивают в неглубоких лотках на поверхности влажных отрубей риса или пшеницы. Во время ферментации рН массы отрубей падает до 1,8—2,0. После окончания процесса лимонная кислота вместе с небольшим количеством одновременно образовавшихся глюконовой и щавелевой кислот экстрагируется водой, а затем осаждается в виде соли кальция. В связи с тем, что отруби богаты железом и другими микроэлементами, используют штаммы A. niger, не чувствительные к высоким концентрациям металлов Такой наиболее простой метод получения лимонной кислоты применяется только в Японии.
Поверхностное культивирование на жидкой среде. Метод поверхностного культивирования широко используется для производства лимонной кислоты в странах Европы и Америки. Поверхность жидкой среды, разлитой в неглубокие кюветы, засевают конидиями гриба-продуцента. Кюветы размещают на стеллажах в термостатированных «бродильных камерах». Гриб развивается в виде плотной пленки на поверхности питательной среды, содержащей высокие концентрации сахара. Образующаяся лимонная кислота переходит из клеток мицелия в раствор, из которого после окончания процесса ее осаждают в виде кальциевой соли, а затем переводят в форму свободной кислоты и кристаллизуют.
Получение посевного материала (спор гриба) проводят в споровом цехе. Такие цехи, имеющиеся только на некоторых заводах, обеспечивают посевным материалом все предприятия. Приготовление питательной среды и превращение сахара грибом в лимонную кислоту, а также последующее отделение мицелия осуществляется в «бродильном цехе». Выделение лимонной кислоты из «сброженных» растворов и получение ее в кристаллическом виде производят в химическом цехе.
В качестве продуцентов лимонной кислоты поверхностным методом на большинстве заводов нашей страны, а также на ряде фирм за рубежом используются мутантные штаммы A. niger (например, Р-1 и Р-3).
Производство посевного материала осуществляют в стерильных условиях следующим образом. Споры исходной музейной культуры высевают на поверхность агаризованной питательной среды, разлитой в алюминиевые кюветы площадью 10—12 дми, последние помещают в термостат. На поверхности среды формируется плотная пленка мицелия, которая затем покрывается конидиями. Через 10 сут пленки просматривают и отбраковывают .те из них, в которых обнаружено незрелое спороношение или инфекция. С поверхности мицелия споры собирают с помощью устройства, работающего по принципу пылесоса, споры просушивают в термокамере при 28—30 °С, смешивают со стерильным активированным углем в отношении 1:2, расфасовывают в стерильные колбы и банки емкостью 0,5—1,0 л, закрывают ватными пробками и сохраняют при комнатной температуре. Срок годности спор 6 мес. В таком виде посевной материал (споры) передается на заводы, производящие кислоту.
Выращивание гриба осуществляют в плоских кюветах (высота бортов до 20 см), расположенных одна над другой на стеллажах в «бродильной камере» (рис. 26.3). В зависимости от размера камеры в ней могут быть расположены два или более стеллажа. На каждом стеллаже размещается 8—10 кювет, расстояние между которыми (по вертикали) 30—40 см. Кюветы изготовляют из нержавеющей стали или чистого алюминия — материалов не подвергающихся коррозии и не загрязняющих среду ионами Fe. Заполнение кювет стерильной средой и слив из них сброженного раствора производится через штуцер в дне кюветы, соединенный шлангом с общим стояком, находящимся вне камеры. Камера оборудована системой приточно-вытяжной вентиляции, обеспечивающей подачу стерильного воздуха необходимой температуры и влажности. Воздух равномерно распределяется по всей камере.
Среду готовят в специальном отделении. В качестве источника углерода в нее вносят сахарозу. При организации первых производств лимонной кислоты сырьем служил кристаллический свекловичный сахар. В 50-е годы на заводах в нашей стране сахар был заменен на свекловичную мелассу (отход сахарного производства). Меласса содержит от 43 до 49% сахарозы, отличается сложностью и непостоянством химического состава. Она содержит большое количество микроэлементов, в первую очередь железо, угнетающее образование кислоты грибом. Поэтому" перед введением в среду мелассу необходимо освободить от ионов металлов. В США мелассу освобождают от металлов с помощью катионообменных смол. В СССР обычно применяется обработка мелассы желтой кровяной солью (KiFe(CN)6) с последующим кипячением раствора. В результате соли железа и других тяжелых металлов осаждаются и их удаляют из раствора сахара.
Подготовленные стерильные кюветы заполняют стерилизованной средой (высота слоя жидкости 12 см) и засевают спорами гриба. Конидии, нанесенные на поверхность питательного- раствора, прорастают, образуется мицелий гриба и прочная пленка, покрывающая всю поверхность раствора. Максимальная интенсивность роста мицелия наблюдается примерно на 4-е сух, что сопровождается активным тепловыделением и образованием СОг. В процессе ферментации происходит постепенное нарастание общей кислотности. Начальное значение рН среды 6,8—7,0 снижается в течение первых трех суток до 4,5, а к концу процесса до 3,0.