Промышленная микробиология

Выше уже отмечалось, что живые иммобилизованные клетки осуществляют как одностадийные, так и многостадийные процессы, даже сложнейшие процессы биосинтеза антибиотиков, ферментов и коферментов. В отличие от свободных клеток они подвергаются специфическим воздействиям уже на стадии иммобилизации. Особое влияние оказывает процесс полимеризации акриловых мономеров. Рассмотрим более детально особенности поведения клеток в полиакриламидном геле (ПААГ).
После включения в ПААГ в зависимости от условий иммобилизации микроорганизмы частично или полностью остаются жизнеспособными. Жизнеспособность определяется либо по количеству колоний, выросших на чашках Петри из клеток, выделенных из гранул, либо по количеству клеток, способных к делению в специальных микрокамерах с питательной средой.
Активность и стабильность иммобилизованных систем с живыми клетками может быть повышена путем их периодической инкубации в питательной среде. В одних случаях достаточно 1—2 инкубации, в других случаях используют частые (1 раз в неделю) инкубации с последующими трансформациями в «голодной» среде.
Таким образом, активность и стабильность иммобилизованных систем, используемых для проведения полиферментных процессов трансформации, регенерирующих не только необходимые ферменты, но и кофакторы, определяются преимущественно способом иммобилизации и природой носителя, условиями иммобилизации и возможностью инкубации в питательной среде, а точнее, возможностью сохранения клеток в жизнеспособном состоянии.
Именно жизнеспособные клетки осуществляют в иммобилизованном состоянии процессы биосинтеза различных органических соединений, в том числе органических кислот, антибиотиков, ферментов и др. (табл. 10.6 и 10.7).
Наиболее изученным следует признать процесс получения этанола, осуществляемый растущими клетками Sacch. cerevisiae. Лучшим из примененных носителей (ПААГ, каррагинан, агар, полиуретан) при производстве этанола оказался Са-альгинатный гель.

Фотопоперечносшитые и уретановые полимеры пригодны для включения клеток, органелл и ферментов. Как исходные препо-лимеры, так и другие используемые реагенты не токсичны для клеток. Большим преимуществом является возможность варьировать гидрофильность этих полимеров. Метод весьма прост и состоит в следующем: фоточувствительный преполимер, например полиэтиленгликольдиметакрилат, расплавляют при 38—40°С, тщательно перемешивают с водной суспензией клеток и добавляют в кристаллическом виде инициатор реакции полимеризации — этиловый эфир бензоина, еще раз перемешивают и выливают на кварцевое стекло (ограниченное бортиками) для получения мембраны толщиной 0,1—0,2 мм. Смесь подвергают действию УФ излучения (254 нм в течение 3—4 мин). Образуется плотная мембрана, которую используют для мембранного реактора, или после измельчения мембраны — для периодического флуидизированиого реактора. Метод весьма перспективен, особенно для живых клеток, органелл и лабильных ферментов.
Возможно включение живых вегетативных клеток и спор с последующим их размножением в геле в присутствии питательной среды. Мицелий, выросший в геле, как правило, имеет ферментативную активность на уровне свободного. Это показано для Rhizopus nigricans (11 а-гидроксилирование) и Curvula-ria lunata (11 (3-гидроксилирование). В последнем случае использование периодических инкубации позволило сохранить неизменной активность в течение двух месяцев (50 трансформаций кортексолона в периодических условиях).
Синтез этанола также весьма успешно осуществляется дрожжами Saccharomyces cerevisiae, введенными в фоточувствительный полимер. Метод прошел 2-летнюю проверку на пилотной установке и используется в Японии с 1985 г. для промышленного производства спирта. Разработана и промышленная установка для получения мембран с клетками высокой производительности.
Бактерии рода Atrhrobacter, включенные в такие полимеры, начали применять для промышленного получения акриламида из акрилонитрила. Акриламид в дальнейшем может быть использован для приготовления гелей и отбеливания бумаги в промышленном масштабе.
Клетки микроорганизмов, иммобилизованные указанным способом, применяют также для реакций трансформации, проводимых в двухфазных системах (вода—органический растворитель). Такие условия используют для трансформации малорастворимых в воде соединений, например стероидов и эфиров ментола.
Кроме указанных выше применяют иные полимеры: различные целлюлозы, коллаген, поливиниловый спирт, поливииилпирроли-дон и др. И в настоящее время продолжается поиск новых носителей с хорошими диффузионными и механическими качествами. Используются комбинации различных методов иммобилизации, например, адсорбция и включение в гель, а также другие приемы, позволяющие улучшить свойства носителей. Наиболее перспективными методами- иммобилизации для живых клеток можно признать следующие: адсорбция на крупнопористых неорганических носителях и включение в Са-альгинатный гель, фоточувствительцые полимеры, каррагииан и полиакриламидный гель.
Для поврежденных клеток наиболее перспективными методами представляются применение ковалентного связывания с активированными носителями и включение в каррагииан. Однако ни один из методов иммобилизации не является универсальным для всех микроорганизмов.

Включение в альгинатные гели относится к мягким методам иммобилизации — клетки остаются живыми и могут осуществлять полиферментные процессы. Положительным качеством геля является возможность клеток размножаться в нем, а также его способность к растворению при изменении рН и температуры. Это позволяет выделять жизнеспособные клетки и облегчает изучение их свойств. Большим преимуществом Са-альгинатного геля являются его хорошие диффузионные качества. В этот гель могут быть включены лишь микроорганизмы и ферменты с очень большой молекулярной массой Кислород, глюкоза, альбумин диффундируют в гель с той же скоростью, что и в водной среде.
Применение клеток микроорганизмов, включенных в альги-натный гель, весьма разнообразно. Механическая прочность шариков или волокон из альгината позволяет их использовать в непрерывных и периодических процессах.
Во многих случаях включение клеток в альгинат приводит к лучшим результатам в сравнении не только с ПААГ, но и с
каррагинаном и другими гелями (при синтезе агроклавина, пенициллина, гидроксилировании прогестерона).
Представляет большой интерес возможность включения клеток растительных и животных тканей в Са-альгинатный гель и осуществление с их помощью процессов трансформации и биосинтеза. При этом биосинтез антрахинонов иммобилизованные растительные клетки осуществляют даже более активно, чем свободные. Фирма LKB (Швеция) рекламирует систему производства моноклональных антител, иммобилизованных в альгина-те. Клетки в геле остаются жизнеспособными 180 сут. и синтезируют за это время 20 кг моноклональных антител.

Поиски более экономичных и эффективных носителей для иммобилизации клеток микроорганизмов привели к полисахаридам природного происхождения. В результате был найден К-кар-рагинан (каппа-каррагинан) — полисахарид из морских водорослей, используемый как пищевая добавка. Полисахарид состоит из структурных единиц сульфата |3-Д-галактозы и 3,6-аи-гидро-а-О-галактозы. Молекулярная масса его 100 000—800 000.
Процесс полимеризации весьма прост: разогретый до 45 °С— 48°С каррагинан смешивают с суспензией клеток и дают затвердеть при охлаждении. Носителю можно придать форму частиц, шариков, мембран, волокон, трубок. Однако без дополнительной обработки механическая прочность его незначительна. Сшивка глутаровым альдегидом и обработка гексаметилендиамииом резко повышает прочность носителя. Обработка повышает активность ферментов и стабильность одностадийных процессов, но снижает жизнеспособность клеток. Например, аспартазная активность клеток Е. coll, включенных в каррагинан, после указанной обработки значительно стабилизируется: период полужизни увеличивается с 50 до 600 сут и более (колонки работали при 37°С).
Использование каррагинана вместо ПААГ и клеток Brevlba-cterlum flavum вместо В. ammoniagenes позволило в пять раз снизить стоимость получаемой яблочной кислоты. Этот метод с 1980 г. используется в промышленном масштабе (Япония).
Живые клетки микроорганизмов, введенные в каррагинан,интенсивно размножаются в присутствии питательной среды и являются активной полиферментной системой, регенерирующей коферменты и необходимые ферменты.
Процессы получения сорбозы, изолейцина и этанола осуществлены в лабораторном масштабе с помощью живых клеток в каррагинане. Оказалось, что микроорганизмы растут в таком геле с той же скоростью, что и свободные клетки, или с большей скоростью. Рост сосредоточен в приповерхностном слое геля, поэтому диффузионные эффекты незначительны, кислород и компоненты питательной среды хорошо потребляются. Метод нашел широкое применение в исследовательской практике, но процессы с применением живых клеток для проведения процессов биосинтеза пока не имеют промышленного применения.

Метод включения клеток в полимеры различной природы имел и имеет в настоящее время.наибольшее применение как в лабораторном, так и в промышленном масштабе. Используют при этом природные полимеры (каррагинан, агар, желатину, хитозан коллаген, различные пектины) и синтетические (полиакриламид-ный гель, фоточувствительные полимеры, полиуретаны, поливиниловый спирт и др.). В зависимости от их механических свойств и характера проводимого процесса полимеры могут использоваться в различной форме: гранул, мембран, волокон.

Фаговый профиль завода — это систематическая регистрация данных о наличии и количестве фагов, активных в отношении используемого на данном предприятии продуцента. ФПЗ дает оценку фагового фона на данном производстве, создающегося путем периодически возникающих и иногда проходящих необнаруженными фаголизисов. Ценность ФПЗ как признака, позволяющего оценить перспективу "бесперебойного производства, очевидно, значительно возрастет, если выявленные фаги удастся отнести к определенной семье. Данные ФПЗ следует обязательно учитывать при смеие продуцентов. Систематическое определение ФПЗ позволяет проследить, как влияет введение новых штаммов на фаговый фон, не появляются ли при этом фаги совершенно новых, ранее неизвестных семей, или отбираются фаги ранее известных семей; последние несут в своем геноме модули, контролирующие ранее неизвестный спектр литической активности.
Систематическое исследование фагов, активных на определенных видах бактерий, в некоторых случаях ведет к предположению, что существует неравномерность в распределении числа разных семей фагов в отношении бактерий определенных видов. Так, вирулентные фаги, выделенные в разное время и в разных географических зонах, активные на одном из штаммов корнебак-терий (продуцентов аминокислот), оказались принадлежащими к одной и той же семье. Возможно, что причиной такой неравномерности является использование лишь ограниченного числа штаммов индикаторных бактерий данного вида. С другой стороны, в определенных случаях нельзя исключать полностью и географического фактора. Действительно, согласно имеющимся наблюдениям фаги, активные в отношении Pseudotnonas putida, выделяются чаще в степных зонах с богатыми почвами. Если эти выводы подтвердятся, их, безусловно, следует принимать в расчет при выборе места для заводов, использующих специфические бактерии-продуценты.
Признак неравномерности распределения разных семей фагов в отношении определенного продуцента важен для промышленности и по другой причине. Использование продуцентов с выраженной неравномерностью с ограниченным числом активных семей фагов или разной частотой фагов разных семей позволяет надеяться на получение фагоустойчивых бактерий, проявляющих устойчивость ко всем известным фагам.

Ковалентное присоединение микроорганизмов к носителям начали применять позднее других методов вследствие токсичности используемых реагентов, например, глутарового и других альдегидов, цианурхлорида и др. Рассматриваемый метод иммобилизации основан на образовании ковалентных связей молекул белков и других соединений клеточной оболочки микроорганизма с активированными бифункциональными реагентами носителями . Возможна предварительная обработка носителя,
например, карбодиимидом, гексаметилендиамином с последующим привязыванием клеток. При этом исключается контакт с токсичным реагентом, активность клеток не снижается либо снижается в меньшей степени, сохраняется жизнеспособность клеток.
Такой метод предложен для проведения различных реакций трансформации, в том числе для использования микроорганизмов с р-галактозидазной и 17 р-оксистероиддегидрогеиазной активностями. Для ковалентного привязывания дрожжевых клеток использовали оксиметакрилатныи гель типа сефарои. Наличие доступных для практического использования синтетических носителей позволило применить метод ковалентного привязывания клеток в пивоваренной промышленности и для получения безлак* тозного молока (ЧССР).
Непосредственное привязывание клеток друг к другу с помощью бифункциональных или полифункциональных реагентов типа альдегидов или аминов относится к «химическому поперечному связыванию». Этот метод даёт хорошие результаты для клеток, проводящих одностадийные процессы, например, с глюко-зоизомеразной, пенициллииамидазной и аминоацилазной активностью. Колонка с поперечносшитыми клетками Streptomyces olivaceus сохраняла глюкозоизомеразную активность неизменной более 40 сут (. Метод ковалентного связывания и поперечной сшивки живых клеток используется реже остальных методов иммобилизации.

Прогресс в бактериофагии обусловлен прежде всего приложением к бактериофагам (в том числе фагам промышленных бактерий) принципов генетических исследований и сосредоточением усилий многих исследователей на изучении относительно небольшого числа фагов (лямбдоидиые фаги, группа Т-четных фагов и др.), послуживших основными фаговыми моделями при разработке принципов молекулярной генетики. Исследование ряда модельных фагов достигло сейчас очень высокого уровня. Для некоторых из них полностью расшифрована нуклеотидная после-довательнось генома, установлены границы генов, определено положение многих мутаций в последовательности нуклеотидов, выявлены промоторы, операторы, терминаторы, определены возможные рамки считывания и соответствующие им белковые продукты и т. д. Вместе с тем продолжается выявление и новых фагов. Некоторые из них становятся удобными моделями для решения определенных проблем. Например, липидсодержащие бактериофаги используют как модель для изучения структуры мембраны; бактериофаги, геном которых представлен несколькими фрагментами РНК, служат хорошей моделью при изучении некоторых сторон репликации вирусов с такими же геномами; бактериофаги-траиспозоиы — прекрасная модель в изучении механизмов транспозиции, играющих существенное значение в канцерогенезе, эволюции и т. д.
Найдены фаги с уникальным способом укладки ДНК в капсиде в виде ниток на шпульке. Детальное изучение механизма такой укладки может дать принципиально новые сведения о взаимодействии белков и ДНК в ходе компактизации и в этом смысле может быть полезным для моделирования структуры хромосом эукариот.
Важно отметить, что многие, с этой точки зрения перспективные фаги выделены при изучении бактерий, используемых в промышленности или имеющих значение для медицины.

Метод адсорбции был, как уже отмечалось, одним из первых, примененных для закрепления клеток. В качестве адсорбентов используют самые различные материалы, природные и синтетические, например керамику, уголь, песок, дробленые раковины, металлическую крошку, капрон, полиуретан .
При адсорбции главную роль играет ионное и электростатическое взаимодействие носителя и поверхности клеток. Однако сродство того или другого микроорганизма к адсорбенту во многих случаях непредсказуемо. Сам метод технологичен. Суспензия клеток смешивается с носителем, перемешивается несколько часов на качалке, лучше выдержать ее затем при 4 °С несколько часов, а затем тщательно отмыть носитель от невключившихся клеток. Положительными качествами метода адсорбции являются также следующие: относительная дешевизна носителей, отсутствие диффузионных затруднений и токсичного воздействия на микроорганизмы. Преимуществом неорганических адсорбентов, кроме того, можно признать устойчивость к воздействию микроорганизмов, стабильность объема при действии давлений и потока субстрата, высокую плотность. Но адсорбция может менять свойства микроорганизмов: размеры, морфологию и скорость размножения клеток, интенсивность некоторых биохимических реакций, что может оказывать положительное или отрицательное влияние на проводимый процесс.
Недостаток метода адсорбции — незначительная прочность удерживания клеток и ограниченное количество биомассы, адсорбируемой единицей носителя. Эти недостатки в значительной мере устраняются при использовании крупнопористых носителей (пористых стекол, керамики). К крупнопористым относятся материалы, имеющие адсорбционную поверхность более 0,01 м2/г. Величина пор при этом должна в несколько раз превышать размер клеток. Показано, например, что для микроорганизмов, размножающихся почкованием, величина пор должна превышать размер клетки в 4—6 раз, а в случае адсорбции спор грибов с последующим прорастанием мицелия — в 12—16 раз. Именно использование такого рода адсорбентов позволило создать установку для переработки органических отходов с. целью получения метана (в США такая установка действовала эффективно в течение 2 лет). Эффективно также использование адсорбированных клеток в процессах очистки сточных промышленных вод.
Оптимизация процессов очистки промышленных сточных вод возможна лишь при работе с иммобилизованными микроорганизмами. При этом используют подращивание микроорганизмов, их пространственное разобщение для направленного разрушения того или иного соединения с помощью подобранных или сконструированных штаммов. Например, с помощью специально селекционированной чистой культуры Bacillus subtllis 23/3, закрепленной на стекловолокне или глинистых минералах, успешно разрушается гексаметилендиамин (токсичное соединение в сточных водах предприятий, выпускающих анидные волокна). В очистных сооружениях устанавливают специальные каркасы с гибкими ершами из стекловолокна, на которых адсорбированы микроорганизмы. Такие системы обезвреживают нитропродукты, ароматические углеводороды и другие соединения в 2—10 раз быстрее, снижают себестоимость очистки, улучшают качество воды. Применение, ершей из стекловолокна с адсорбированными клетками освоено в полупроизводственных биотенках объемом 24 м3.

Клетки микроорганизмов — неиссякаемый источник ферментов. Они способны выполнять самые тонкие реакции и сложнейшие многостадийные синтезы. Такие процессы не всегда могут быть воспроизведены путем химического синтеза. Кроме того, химические методы в ряде случаев уступают микробиологическим по эффективности, так как имеют больше стадий, происходят в агрессивных средах под высоким давлением и дают низкий выход. Можно отметить еще одно качество микроорганизмов — удивительную стабильность их ферментатов в закрепленном (иммобилизованном) состоянии. Иммобилизованные тем или иным способом клетки микроорганизмов удается использовать для проведения трансформации или биосинтеза ряда соединений в течение нескольких месяцев и даже лет. Следует напомнить, что в природе, а именно в почвах, в илах, в горных породах, на поверхности растений микроорганизмы в основном существуют в закрепленном состоянии. Еще 150 лет тому назад Шутценбах в Германии использовал закрепленные на буковой стружке бактерии для производства уксуса. Особое внимание привлекли иммобилизованные клетки в конце 60-х —- начале 70-х годов XX столетия.
На десятилетие раньше начались работы по иммобилизации ферментов. Закрепление глюкозоизомеразы, аспартазы, пени-циллинамидазы и многих других ферментов на носителях привело к значительной стабилизации их активности. В иммобилизованном виде были получены и сложные, полиферментные системы. Но необходимость добавления кофакторов и частичной очистки ферментов приводит к увеличению относительной себестоимости осуществляемых реакций. В настоящее время лишь несколько процессов с использованием иммобилизованных ферментов имеют крупномасштабное применение.
1. Получение 6-аминопенициллановой кислоты с помощью иммобилизованной пенициллинамидазы (СССР, Япония, Финляндия).
2. Получение глюкозо-фруктозных сиропов с использованием иммобилизованной глюкозоизомеразы (США, Великобритания, Голландия, Финляндия, Дания, Япония).
3. Разделение рацемических смесей аминокислот с использованием иммобилизованной аминоацилазы (Япония).
4. Получение безлактозмого молока с использованием иммобилизованной лактазы (ЧССР, США, Италия). В большинстве случаев это непрерывные процессы, протекающие в колонках. Производительность 1 кг иммобилизованной глюкозоизомеразы составляет 600—6000 кг, активность снижается на 50 % через 20—70 сут.
В период активного изучения иммобилизованных ферментов было показано, что соответствующие клетки микроорганизмов также могут во многих случаях осуществлять одностадийные и многостадийные процессы. В 1970 г. Мосбах с соавт. (Швеция) опубликовал результаты изучения возможности проведения такого сложного, НАД-за-висимого процесса, как гидроксилирова-ние стероидов с помощью иммобилизованного в полиакриламид-ный гель (ПААГ) мицелия гриба Curvularia lunata.
Анализ имеющегося экспериментального материала позволяет говорить об определенных преимуществах использования иммобилизованных микроорганизмов перед иммобилизованными ферментами и свободными клетками.
1. Отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов.
2. Уменьшение затрат на выделение и очистку продуктов реакции, которые отделены от биомассы или фермента.
3. Более высокая ферментативная активность (в некоторых случаях) и высокая стабильность ферментов в иммобилизованных клетках.
4. Возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов при промышленном производстве.
.5. Способность к длительной регенерации кофакторов (при использовании живых иммобилизованных клеток).
Известны и трудности при использовании иммобилизованных клеток: наличие в некоторых случаях побочных процессов, а также дополнительного диффузионного барьера для субстрата и продукта, которым являются клеточная стенка и цитоплазмати-ческая мембрана. Однако эти трудности преодолимы, более того, именно при иммобилизации появляются новые возможности для направленного изменения ферментативной активности микроорганизмов и ее увеличения по сравнению со свободными клетками.