Промышленная микробиология

Полисахариды (или гликаны) — полимеры, построенные не менее чем из 11 моносахаридных единиц. Они могут состоять из одного или нескольких типов моносахаров. Соответственно различают гомополисахариды и гетерополисахариды. Полисахариды — обязательные компоненты всех организмов, составляют большую часть углеводов, встречающихся в природе, преобладающую долю в биомассе растений, а следовательно, и основную массу органического вещества на Земле.
Полисахариды встречаются в виде самостоятельных полимеров, а также в комплексах с нуклеиновыми кислотами, белками, липидами, фосфатом. Разнообразны они по мономерному составу и структуре. Особым разнообразием отличаются полисахариды микроорганизмов. Некоторые из них близки или идентичны полисахаридам растений и животных. Но подавляющее большинство микробных полисахаридов имеет уникальную структуру, специфическую для вида или для серологической группы вида. В микробных гликанах часто обнаруживаются ранее неизвестные моносахара, которые не встречаются ни у животных, ни у растений.
О том, что слизь, образуемая многими микроорганизмами, может иметь углеводную природу, знали еще во времена Пасте-ра. Однако особое внимание микробным полисахаридам стали уделять лишь с начала 20-х годов нашего столетия, когда узнали, что вещества, определяющие серологическую специфичность пневмококков, являются полисахаридами. В настоящее время исследование микробных полисахаридов приобрело особое значение в связи с открывшейся возможностью широкого применения их в медицине и ряде областей народного хозяйства.
Полисахариды микроорганизмов в соответствии с локализацией делятся на внутриклеточные и внеклеточные. К внутриклеточным относят обычно полисахариды цитоплазмы, мембран и клеточных стенок, а к внеклеточным — полисахариды капсул, чехлов (пристеночные структуры) и свободной слизи, не прилегающей к клеточной стенке. Иногда к внеклеточным относят также полисахариды, локализованные снаружи от цитоплазмати-ческой мембраны. В этом случае в группу внеклеточных попадают и полисахариды клеточных стенок. У ряда микроорганизмов действительно трудно различить границу между капсулой и клеточной стенкой.
Нередко ,по локализации выделяют три группы полисахаридов: внутриклеточные (цитоплазмы, мембран, периплазмы), полисахариды клеточных стенок и внеклеточные (капсул, чехлов и свободной слизи).
Термин «экзогликаны» применяют в основном к полисахаридам свободной слизи. Иногда экзогликанами называют также капсульные полисахариды.
Микробные полисахариды объединяют в группы и по функциям: резервные, участвующие в активном транспорте, опорные, участвующие во взаимодействии между клетками, защитные и др.
Некоторые исследователи классифицируют полисахариды, учитывая их топологию и функции. В соответствии с этим клеточные полисахариды подразделяются на две группы. Одна включает резервно-энергетические и модификаторы (внутриклеточные), вторая — структурные и структурно-метаболические (в клеточной стенке). К внеклеточным относятся выделяющиеся при гиперпродукции структурно-метаболические гликаны и собственно экзогликаны.

В настоящее время полисахариды микроорганизмов достаточно широко используются в практике . Они находят применение в самых различных сферах человеческой деятельности: в медицине, фармацевтической, пищевой, химической и текстильной промышленности, в гидрометаллургии, при добыче нефти и в ряде других областей народного хозяйства. При этом внимание исследователей и практиков привлекают и внутриклеточные и внеклеточные гликаны, однако в технико-экономическом плане предпочтительнее последние — масштаб их производства и применения значительно шире.
Возможность и перспективность использования полисахаридов в медицине в значительной мере определяется их биологической активностью.
Многие микробные полисахариды обладают лечебным и профилактическим действием: повышают устойчивость организма к бактериальным и вирусным инфекциям, обладают противоопухолевой активностью, способствуют заживлению ран и регенерации тканей, благоприятно влияют на течение и исход воспалительных процессов, устраняют болевой синдром, снижают побочное действие лекарственных препаратов и рентгенотерапии. Лечебное и защитное действие полисахаридов определяется прежде всего их способностью повышать неспецифическую иммунобиологическую реактивность организма, влиять на различные защитные реакции, поддерживающие постоянство его внутренней среды. Преимущества многих полисахаридных препаратов перед другими средствами, повышающими неспецифическую резистентность организма, определяются тем, что они свободны от примесей, оказывающих нежелательное действие на организм. Некоторые микробные полисахариды уже нашли применение в лечебной практике различных клиник мира.
В нашей стране для лечения последствий травм и нарушений проводимости нервной системы, для предупреждения образования грубых послеожоговых или посттравматических рубцов успешно применяли пирогеналь — препарат, выделяемый из клеток Salmonella typhi и Pseudomanas aeruginosa. В ФРГ и США с этой же целью использовали липополисахариды, изолированные из различных патогенных бактерий. Бактериальные ЛПС обладают также и противолучевой активностью.
В клиниках Советского Союза уже более 20 лет применяют продигиозан — гетерополисахаридный комплекс с липидами, выделенный из клеток Serratia marcescens, и зимозан — препарат из оболочек клеток Sacch. cerevisiae, состоящий из глюкана, глюкоманнана и минорных количеств тейхоевых кислот. Эти препараты нормализуют ряд сдвигов в иммунобиологических реакциях, оказывают положительное действие при лечении опухолей, ряда инфекционных и неинфекционных заболеваний. Перспективны в качестве противоопухолевых агентов ЛПС ряда грамотри-цательных бактерий, внутриклеточный глюкан парамилон (аста-зиан) бесцветных фитофлагеллят Astasia longa, внеклеточные полисахариды различных дрожжей родов Lipomyces, Cryptococ-cus, Bullera и др., бактерий родов Alcaligenes и Agrobacterium. Перечисленные соединения рекомендованы для клинических испытаний. Противовирусную активность проявляет продигиозан. Модифицированный (сульфатированный) полярный маннан — внеклеточный полисахарид Rhodotorula rubra — перспективен как средство профилактики и лечения атеросклероза.
Полисахариды, обладающие антигенной специфичностью, начинают использоваться в медицинской практике в качестве диагностических средств. К ним относятся, например, полисаха-ридные препараты патогенных и условно патогенных видов дрожжей рода Candida, облегчающие диагностику заболеваний кандидознои природы. Показана возможность использования модифицированных ЛПС-антигенов сальмонелл в диагностике сальмоиеллезов.
Очищенные специфические полисахариды менингококков групп А и С (полимеры N-ацетил, О-ацетилманнозаминфосфата и N-ацетил, О-ацетилнейраминовой кислоты соответственно) используются для получения менингококковых вакцин. Микробные полисахариды могут быть основой для создания искусственных вакцин. Достигается- это изменением их конфигурации или конъюгацией с синтетическими полиэлектролитами.
Нейтральные декстраны с молекулярным весом около 75 000, продуцируемые L. mesenieroides, широко применяются у нас в стране и за рубежом в качестве заменителей плазмы крови. Перспективны как плазмозаменители пуллулан, а также леваны, синтезируемые G. oxydans и Вас. polymyxa. Декстраны определенного строения, как и многие другие полисахариды, способны стимулировать защитные реакции организма. В клиниках они применяются в комплексе с другими препаратами для лечения различных заболеваний брюшной полости. Сульфаты декстрана обладают антикоагулирующим действием, заменяют гепарин и могут применяться как антитромбогенное средство. В качестве антикоагулянта перспективен также хитин.
Широкое применение микробных полисахаридов в фармацевтической, парфюмерной, пищевой и других отраслях промышленности определяется их свойствами: вязкостью, реологическими характеристиками, способностью к набуханию, взаимодействием с определенными структурами. В фармацевтике они используются в качестве основы для изготовления лекарственных форм: как мягчители, эмульгаторы и стабилизаторы суспензий, как склеивающие агенты и разрыхлители в мазях, пилюлях, таблетках. Они обеспечивают длительную устойчивость лекарственных препаратов, стабилизируют и пролонгируют их действие. На базе некоторых микробных полисахаридов (аубазидан, декстран) созданы стабильные в течение нескольких лет лекарственные препараты: бутадиона, серы, сульфаниламидов, суспензии сульфата бария для рентгеноскопии и др. Макромолекуляр-ные конъюгаты модифицированных декстранов с ферментами (стрептокиназой, трипсином, фибринолизином) пролонгируют активность ферментов и снижают их аллергизирующее действие.

Кислотность среды. Обычно существуют определенные границы рН, допускающие рост микроорганизмов и синтез полисахаридов; эти интервалы у разных микроорганизмов неодинаковы. У ряда представителей границы, а иногда и оптимальные значения рН для роста и образования гликанов совпадают, но в отдельных случаях они различаются. У некоторых микроорганизмов количество полисахаридов не меняется в зависимости от рН среды. Чаще же изменение кислотности среды влияет на выход гликанов, на количественное соотношение полисахаридов, если их образуется несколько (аубазидан и пуллулан в культуре A. pullulans), на их молекулярную массу. Например, увеличение рН среды от 5,0 до 8,0 способствует образованию высокомолекулярных фракций декстранов разными штаммами стрептококков, но мономерный состав гликанов при изменении рН среды, по-видимому, не меняется.
Аэрация и температура. Влияние аэрации и температуры на биосинтез полисахаридов очень разнообразно. Режимы аэрации и температуры, благоприятные для образования того или иного гликана, могут сильно различаться.
Большинство микроорганизмов, образующих экзогликаны, — аэробы или факультативные анаэробы, поэтому в условиях хорошей аэрации выход экзогликанов в культурах таких микроорганизмов выше. Однако избыточное аэрирование может угнетать их биосинтез вследствие быстрого окисления углеродного субстрата.
В отношении действия температуры также наблюдается определенная закономерность. Максимальное образование гликанов часто происходит при температуре ниже оптимальной для роста микроорганизмов. Так, количество декстрана в культуре L. те-senteroides увеличивается с уменьшением температуры с 30 до 10 °С. Но в некоторых случаях температурные оптимумы роста бактерий и образования ими экзогликанов совпадают.
Изменение температуры культивирования микроорганизмов иногда приводит к синтезу полисахаридов с измененными свойствами. Например, известен штамм стрептококков, синтезирующий при 22 °С внеклеточный полисахарид, отличающийся более высоким содержанием глюкозамина и иными иммунохимическими свойствами, чем гликан, образуемый при 37 °С.

Внеклеточные полисахариды, как уже отмечалось, обнаруживаются в виде капсул и чехлов, прилегающих к клеточным стенкам, а также свободной слизи. Капсулы, имеющие толщину менее 0,2 мкм, не различимые в световом микроскопе, но хорошо видимые в электронный микроскоп, называют микрокапсулами. Микрокапсулы обычно связаны с клеточной стенкой прочнее, чем капсулы. У многих микроорганизмов капсулы имеют определенную структуру и четко отграничены от слизи. У некоторых бактерий капсульный материал рыхлый, бесструктурный, легко отторгается от клеток, поэтому границу между капсулой и свободной слизью в этом случае определить трудно. Такие аморфные капсулы называют слизистыми слоями. Чехлы в отличие от капсул имеют сложную структуру. В них нередко различают несколько слоев с разным строением. Количество внеклеточных полисахаридов может во много раз превышать биомассу клеток.
Капсулы, чехлы и слизь не всегда состоят только из полисахаридов. Они могут кроме гликанов включать белки, полипептиды, нуклеиновые кислоты, липиды, образующие или не образующие комплексы с полисахаридами. Как правило, чехлы имеют более сложный химический состав. Так, у Sphaerotllus natans они содержат глюкозу, глюкозамин, белок, липид и фосфат. Чехлы бактерий, окисляющих восстановленные соединения металлов, часто содержат включения их окислов. Иногда неуглеводные полимеры — единственные компоненты капсул и слизи. Так, капсулы некоторых видов рода Bacillus построены из полипептида, слизь некоторых штаммов Pseudomonas aeruginosa состоит из ДНК.
Внеклеточные полисахариды, капсульные или свободные, или те и другие, образуют многие микроорганизмы. Пожалуй, нет такой группы микроорганизмов, представители которой не обладали бы этой способностью. Однако синтез внеклеточных полисахаридов — не обязательная функция клетки и проявляется она лишь в определенных условиях. Встречаются микроорганизмы, у которых никогда не удавалось наблюдать ни капсул, ни слизи.
Внеклеточные полисахариды микроорганизмов чрезвычайно разнообразны по составу и строению. К настоящему времени исследован состав около 200 экзогликанов, установлены первичная структура и детали строения многих из них. В составе внеклеточных полисахаридов различных микроорганизмов обнаружено более 20 моносахаров и их производных. Наиболее часто встречаются гексозы: глюкоза, галактоза, манноза и 6-дезокси-гексозы: фукоза и рамноза. Реже выявляются пентозы: араби-ноза, ксилоза, рибоза. Распространены уроновые кислоты: галак-туроновая, маннуроновая и особенно глюкуроновая. Многие содержат аминосахара: глюкозамин, галактозамин и маннозамин. Часто в экзогликанах присутствуют неуглеводные заместители — пируват и ацетат, встречаются также сукцинат и глицерин. Для ряда внеклеточных гликанов характерно наличие редких мономеров: 2,6- или 3,6-дидезоксисахаров, у некоторых найдены ранее неизвестные моносахариды, например гликолактиловые кислоты (у сапротрофных микобактерии). Иногда обнаруживаются тейхоевые кислоты, фосфатные и сульфатные ионы.
Внеклеточные полисахариды большинства видов бактерий — кислые гетерогликаны разнообразного состава, построенные из 2—5, иногда 6—7 мономеров, линейные и разветвленные, имеющие регулярную структуру из повторяющихся олигосахаридных звеньев. Так, например, Xanthomonas campestris синтезирует полианионит ксантан, включающий глюкозу, маннозу, глюкуро-новую кислоту и О-ацетильиую группу и пируват.
Некоторые бактерии образуют нейтральные гетерополисаха-риды.
Весьма распространены у микроорганизмов различные гомо-полисахариды, особенно глюкаиы, из которых наиболее известны декстраны (группа более или менее близких по строению нейтральных глюканов). Они могут содержать до 200 000 остатков глюкозы, бывают линейными и разветвленными. Линейная (основная) цепь построена при участии а-1,6-связей, ветвление обусловлено а-1,2-, а-1,3- и а-1,4-связями. Молекулярная масса декстранов колеблется от 12 до 600 млн. Наиболее активные продуценты декстранов — представители молочнокислых бактерий Leuconostoc mesenteroides и L. dextranicum. Декстраны синтезируются также некоторыми видами Streptococcus (Str. sanguis, Str. mutans), Brevibacterium, Lactobacillus. Практически каждый продуцент синтезирует свой, несколько отличный от других видов декстран. Некоторые штаммы образуют одновременно два различных по структуре декстрана.
Внеклеточную целлюлозу — полисахарид, распространенный в растениях, из бактерий синтезируют некоторые представители Pseudomonas, Zooglea, Azotobacter, подавляющее число видов Rhizobium и Agrobacterium, Acetobacter xylinum, р-(1-»-3)-Глю-кан, называемый курдланом, образуют Alcaligenes faecalis var. myxogenes и виды Rhizobium. Сильно разветвленный а-(1-»~ - 4)-глюкан с боковыми цепочками, присоединенными а-(1- --»-6) --связями, — полимер типа гликогена, резервного полисахарида животных, многих бактерий и дрожжей — можно обнаружить в культуральной жидкости Neisseria perflava. Нигеран — а-глюкан с чередующимися (1- 4)- и (1- 3)-связями — образует гриб Aspergillus nlger.
Разветвленные полимеры фруктозы—леваны с (2 - 6) -связями — синтезируют уксуснокислые бактерии Gluconobacter оху-dans, Acetobacter aceti, некоторые виды Pseudomonas, Erwlnia (подгруппы «herbicola»), Aeromonas, Bacillus. Фруктаны типа инулина (резервный полисахарид растений семейства сложноцветных) с (2-*-1)-связями в основной цепи и ответвлениями в положении С6 образуют штаммы Str. mutans.
Маннаны обнаружены в культурах некоторых видов Bacillus и Corynebacterium, а также у многих дрожжей.
Чаще всего микроорганизмы, способные к образованию внеклеточных полисахаридов, синтезируют капсулы и свободную слизь. Мономерный состав слизи и капсул в большинстве случаев одинаковый.

У грамположительных эубактерии полисахариды составляют от 30 до 60% сухой массы клеточной стенки. Значительная их часть входит в состав муреииового комплекса, количество которого у грамположительных эубактерии достигает 50—90% веществ клеточной стенки. Линейные полисахаридные цепи муреи-на построены из повторяющихся |3-1,4-связанных единиц N-аце-тилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты. Мурамовая кислота — производное глюкозамина, содержащее D-молочную кислоту.
Клеточные стенки некоторых архебактерий, дающих положительную окраску по Траму, содержат псевдомуреин, гликановая часть которого состоит из N-ацетилглюкозамина, N-ацетил-галактозамина и N-ацетилталозаминуроновой кислоты. Мурамо-вая кислота в псевдомуреине не найдена. У ряда грамположи-тельных архебактерии клеточная стенка построена только из кислого гетерополисахарида, в состав которого входят галактоз-амин, нейтральные сахара и уроновые кислоты. В клеточных стенках подавляющего большинства грамположительных эубак-терий, за исключением микобактерий и коринебактерий, содержатся тейхоевые кислоты. Их количество обычно достигает 50— 90% от массы клеточной стенки, у стрептомицетов оно колеблется от 4 до 50%. Как правило, у микроорганизмов обнаруживается либо глицеринтейхоевая, либо рибиттейхоевая кислота. Однако у Streptococcus faecalis и у одного штамма Streptomyces sp. найдены тейхоевые кислоты обоих типов.
Другие полисахариды, содержащиеся в клеточных стенках грамположительных бактерий, отличаются большим разнообразием; чаще всего это1 гетерогликаны. В их составе обнаруживаются нейтральные моносахара, аминосахара, уроновые кислоты, ацетильные группы, остатки фосфорной кислоты.
Клеточные стенки грамотрицательных бактерий содержат от 1 до 50% полисахаридов. Среди них полисахариды муреинового комплекса не занимают доминирующего положения, так как его количество составляет в среднем всего около 5% веществ клеточной стенки. Тейхоевые кислоты обнаруживаются только у отдельных представителей грамотрицательных бактерий.
Особенно характерны для клеточных стенок грамотрицательных бактерий липополисахариды (ЛПС) — биологически активные вещества, участвующие в формировании наружной мембраны. Число различных липополисахаридов велико и, несмотря на интенсивное изучение, строение и состав многих из них известны не до конца. В полисахаридной части комплекса различают базисную структуру и О-специфические боковые цепи. Моносаха-ридный состав, варьирование связей и структура их в основном и определяют биологическую активность липополисахаридов, выполняющих функцию соматических антигенов. Углеводный компонент липополисахарида — это обычно гетерополисахарид. У различных бактерий в его составе обнаружены нейтральные сахара, аминосахара, уроновые кислоты, метильные и ацетильные группы и, что особенно характерно, 3,6-дидезоксипроизвод-ные Сахаров, которые в других природных объектах встречаются редко. Из них наиболее распространены абеквоза (3,6-дидезокси-D-галактоза), колитоза (3,6-дидезокси-Ь-галактоза), тивелоза (3,6-дидезокси-0-манноза), аскаридоза (3,6-дидезокси-Ь-манно-за) и паратоза (3,6-дидезокси-0-глюкоза). Эти сахара часто определяют серологическую специфичность бактерий. В О-спе-цифической боковой цепи липополисахарида одного из видов рода Pasteurella обнаружена 6-дезокси-6-манногептоза — первая 6-дезоксигептоза, найденная в природе. Моносахариды особого типа — гликолактиловые кислоты — выявлены в составе О-антигенных полисахаридов представителей рода Shigella. Полиса-харидные компоненты ЛПС ряда бактерий отличаются сложностью. Они могут содержать до 6 и более различных незамещенных и замещенных моносахаров. У энтеробактерий молекулы ЛПС могут образовывать комплексы с пептидогликаном, кислыми капсульными гликанами и другими гетерополисахаридами клетки.
Полисахариды — главные компоненты клеточной стенки дрожжей и мицелиальных грибов. Они могут составлять до 90% массы клеточной стенки (Saccharomyces cerevislae). У дрожжей часто обнаруживаются гомогликаны: глюканы, маннаны, хитин (полимер N-ацетилглюкозамина). В дрожжевых маннанах нередко содержатся остатки фосфорной кислоты и (или) метальные группы, а в глюканах — ацетильные и аминогруппы. У многих дрожжей в клеточной стенке обнаруживаются гетерополи-сахариды — галактоманнаны и глюкоманнаны, а также кислые гликаны, построенные из 3—4 мономеров. По-видимому, в клеточных стенках дрожжей присутствует несколько полисахаридов. Гликаны клеточных стенок дрожжей могут быть связаны с пептидами.
Основным полисахаридиым компонентом клеточных стенок большинства исследованных мицелиальных грибов является хитин. Обнаруживаются также неацетилированный или частично ацетилированиый полимер глюкозамина — хитозан, глюканы (иногда целлюлоза), галактаны и различные гетерополисахари-ды, включающие незамещенные и замещенные сахара, уроно-вые кислоты.
Структурные микрофибриллы клеточных стенок большинства микроформ водорослей состоят из целлюлозы, а у отдельных представителей — из других гомополисахаридов, часто из ксила-нов и маннанов. Количество их может достигать 50—80% массы сухой клеточной стенки. Полисахариды матрикса представлены в основном гетерогликанами. Обнаруживаются и сульфатиро-ваиные полисахариды.
Полисахариды клеточных стенок выполняют разнообразные функции. Многие из них определяют механическую прочность клеточных стенок. Поэтому их часто называют «скелетными». Липополисахариды, тейхоевые кислоты, а также гетерополисаха-риды ряда грамположительных бактерий ответственны за антигенную активность клеток. ЛПС значительного числа грамотрица-тельных бактерий — токсины. ЛПС энтеробактерий защищают клетки от ингибирующего действия длинноцепочечных жирных кислот, позволяя этим бактериям выживать в кишечнике животных. С наличием О-специфических боковых цепей ЛПС связана способность шигелл прикрепляться к надмембранному покрову эпителиальных клеток. Многие полисахариды определяют устойчивость бактерий к литическим ферментам и фагам. Полианионные полисахариды способствуют транспорту из клетки заряженных метаболитов и веществ, поступающих в нее из окружающей среды. Кроме того, такие полисахариды сообщают кле/гке отрицательный заряд, в результате чего происходит взаимное отталкивание клеток, диспергирование их в среде. Потеря О-боковых цепей ЛПС снижает гидрофильность клеток и приводит к их спонтанной агглютинации. Полисахариды клеточных стенок микроорганизмов, растущих на средах с w-алканами, обычно являются хорошими эмульгаторами и тем самым способствуют проникновению углеводородов в клетку.

Полисахариды цитоплазмы обнаруживаются в двух формах: они могут быть диспергированы в ней или объединены в гранулы. Обычно в цитоплазме бактерий содержится 20—30% полисахаридов, а в условиях, способствующих их накоплению, до 50— 60% от массы сухих клеток. Чаще всего в цитоплазме микроорганизмов обнаруживают гомогликаны, из которых особенно распространены глюканы типа гликогена. Их выделяли из цитоплазмы многих прокариотных и эукариотных микроорганизмов: представителей разных родов бактерий Agrobacleriurn, Arlhro-bacter, Bacillus, Clostridium, Escherichia, Mycobacterium, Nostoc, Rhodopseudomonas, Rhodospir ilium, Streptococcus, а также дрожжей, мицелиальных грибов, ресничных и жгутиковых простейших, некоторых водорослей. Кроме гликогеноподобных полисахаридов в цитоплазме ряда микроорганизмов найдены крахмал, маннаны, леваны, арабаны и ксиланы. Гликоген и другие гомогликаны цитоплазмы могут образовывать комплексы с ДНК, РНК, белками, липидами, фосфатом. Гетерополисахариды обнаруживаются в цитоплазме реже. Однако у представителей Strep-tomyces и Mycobacterium они оказываются преобладающими.
Функции полисахаридов цитоплазмы до донца не выяснены. До недавнего времени считали, что основное или даже единственное их назначение — быть резервным источником углерода и энергии для клетки. Они расходуются, например, при созревании эндоспор у бактерий родов Bacillus и Clostridium. Но теперь ясно, что полисахариды цитоплазмы могут выполнять ряд других важных функций. Предполагается, что комплексы го-могликанов с другими компонентами цитоплазмы участвуют в механизмах клеточной регуляции, контролирующих синтез различных веществ, рост и деление клеток. Так, гликогенрибосом-ные комплексы, возможно, контролируют синтез белков. Гликоген может оказывать радиозащитное действие на связанные с ним молекулы нуклеиновых кислот.
В мембранах микроорганизмов обнаруживается в среднем от 2 до 5%, иногда (у Micrococcus luteus) до 15—20% углеводов от массы мембраны. Возможно, в некоторых случаях эти углеводы полностью или частично представляют собой остаточный материал цитоплазмы или клеточных стенок. Тем не менее достоверно показано, что в мембранах грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий содержатся гликолипиды и гликопротеины.
Все грамположительные эубактерии, за исключением микрококков и некоторых стрептококков, а также дрожжи и мицели-альные грибы содержат в области цитоплазматической мембраны тейхоевые кислоты (1—2% от сухой биомассы). Тейхоевые кислоты относят к кислым полисахаридам необычного строения. При их гидролизе наряду с моносахаридами образуются вещества, относящиеся к другим классам соединений. Разнообразие тейхоевых кислот определяется в основном числом присутствующих в них остатков Сахаров и наличием связей различных типов. Мембранные тейхоевые кислоты — это всегда глицерофос-фатные полимеры, часто связанные с гликолипидами и фосфо-липидами (липотейхоевые кислоты). У некоторых микроорганизмов выявляются только липотейхоевые кислоты, а свободных тейхоевых кислот нет. В мембранах грамотрицательных бактерий тейхоевые кислоты не обнаружены.
Мембранные гликолипиды участвуют в биосинтезе полисахаридов и транспорте Сахаров. Тейхоевые кислоты, видимо, регулируют ионный обмен (связывают двухвалентные катионы, что необходимо для нормального функционирования ферментов, локализованных в мембране), действуют на связывание аминокислот с тРНК, осуществляют связь между мембраной и клеточной стенкой, проявляют антигенную активность.

Вопросам промышленного получения липидов с помощью микроорганизмов уделяется пристальное внимание как в нашей стране, так и за рубежом. Микроорганизмы можно использовать для получения фосфолипидов, гликолипидов, незаменимых жирных кислот и препаратов на их основе, необходимых для использования в медицинской практике, сельском хозяйстве, пищевой и других отраслях промышленности.
Ряд дрожжей и мицелиальных грибов рассматривается как потенциальные продуценты липидов, в том числе липидов — аналогов некоторым типам растительных масел. Мировая практика пока не имеет производств с целевым назначением получать микробные липиды. Однако изменение конъюнктуры на мировом рынке не исключает целесообразности организации получения липидов путем микробиологического синтеза.
В настоящее время в небольших объемах получают липиды только с помощью дрожжей, причем липиды являются побочным продуктом основного производства (при получении белково-витаминных концентратов на углеводородах нефти). Получение липидов из мицелиальных грибов, а также бактерий, водорослей и простейших пока не вышло за рамки лабораторных исследований. Одной из причин медленного решения вопросов получения бактериальных липидов следует признать наличие в их составе соединений, токсичных для макроорганизма.
С помощью дрожжей возможно получение липидов на различных субстратах: гидролизатах растительного сырья, сульфитных щелоках, углеводородах нефти и др. Эффективность производства дрожжевого жира во многом связана с количеством ос-нового сырья, необходимого для получения определенной единицы массы дрожжей, и его стоимостью. Кроме того, сырье, на базе которого готовится питательный субстрат для выращивания дрожжей, должно обеспечивать получение липидов, отвечающих требованиям, предъявляемым промышленностью, перерабатывающей липиды в различные продукты.
Наиболее отработаны технологические схемы получения липи-дов с помощью дрожжей на гидролизатах верхового торфа малой степени разложения и углеводородах нефти. Эти схемы различаются тем, что при получении липидов на гидролизатах торфа дрожжевой жир является основным продуктом, а при использовании углеводородов дрожжевой жир — побочный продукт, появляющийся в результате очистки дрожжевой биомассы от остаточных углеводородов. В связи с этим и фракционный состав получаемых этими путями липидов весьма различен: доминирующая фракция углеводородных дрожжей — фосфоли-пиды, основная фракция при получении липидов на гидролизатах торфа—триацилглицерины. В нашей стране процесс получения дрожжевых липидов в условиях специализированной установки осуществлен на Кстовском опытно-промышленном заводе белково-витаминных концентратов, вырабатывающем сотни тони этого продукта биосинтеза. В ближайшие годы планируется ввод в строй нескольких установок по получению липидов из дрожжей способом, аналогичным кстовскому.
Процесс получения липидов на гидролизатах верхового торфа малой степени разложения включает несколько основных операций: получение гидролизата торфа, отдувка фурфурола и нейтрализация гидролизата до рН 5,5—6,0, введение в гидролизат минеральных источников питания, выращивание дрожжей — продуцентов липидов, отделение биомассы и экстракция из нее липидов. Следовательно, весь процесс аналогичен процессу получения кормовых дрожжей, за исключением дополнительных операций, связанных с извлечением липидов. Система растворителей, применяемая для этой цели, идентична используемым в масло-жировой промышленности. Оставшаяся после экстракции липидов биомасса «биошрот» может быть использована в кормлении сельскохозяйственных животных.
Продуцентами липидов на гидролизатах торфа являются выделенные в институте микробиологии АН БССР штаммы Lipomy-ces lipoferus, биомасса которых содержит до 40 % липидов и более. Из одной тонны абсолютно сухого торфа можно получить 50—70 кг дрожжевых липидов, содержащих до 70—75 % три-ацилглицеринов.
Кроме гидролизатов торфа для культивирования липидооб-разующих дрожжей и получения липидов по указанной выше схеме могут быть использованы другие гидролизные среды, например, гидролизаты древесины, или смешанные субстраты древесины и торфа.

Многочисленные эксперименты по влиянию источников углерода на синтез липидов у дрожжей и мицелиальных грибов показали, что они оказывают влияние не столько на количество, сколько на состав образуемых липидов. Приспосабливаясь к новым условиям питания, микроорганизм в конечном счете может синтезировать примерно такое же количество липидов, как и на специфических для него средах. Что же касается состава жирных кислот, то он во многом определяется характером тех промежуточных продуктов, которые появляются в процессе превращения различных источников углеродного питания.
Особое влияние на состав жирных кислот в синтезируемых липидах оказывают соединения, которые сами входят в их состав . Так, при использовании микроорганизмами в качестве источника углерода высших жирных кислот последние в большом количестве включаются в состав липидов. При использовании углеводородов основные жирные кислоты клеток либо имеют длину цепи потребляемого алкана, либо появляются в результате изменения длины углеродной цепи молекулы исходного алкана на четное число углеродных атомов.
В отличие от соединений углерода соединения азота не оказывают прямого влияния на биосинтез липидов. Их влияние связано со сдвигом равновесия питательной среды в сторону от оптимума значения рН, характерного для ли пидообразования. В то же время концентрация источника азота играет существенную роль в процессах липидообразования. Связано это с соотношением азота и углерода в среде. Чем это соотношение выше в сторону углерода, тем более благоприятны условия для биосинтеза липидов, и наоборот.
На процессы биосинтеза липидов у микроорганизмов оказывают влияние также рН среды и температура культивирования. Так, повышение рН среды увеличивает содержание в составе дрожжевых липидов свободных жирных кислот, фосфолипидов и уменьшает содержание триацилглицеринов. При снижении рН увеличивается общая ненасыщенность липидов.
Снижение температуры культивирования ведет к повышению степени ненасыщенности клеточных липидов.
Кроме источников углеродного и азотного питания, а также рН, аэрации, температуры на процессы роста микроорганизмов и синтеза ими липидов определенное влияние оказывают различные компоненты минерального питания и некоторые витамины.
Отсутствие в среде пантотеновой кислоты отрицательно влияет не только на синтез общих липидов, но и на образование некоторыми дрожжами эргостерина. Определенное влияние на процессы липидообразования у дрожжей и других организмов могут оказывать также пара-аминобензойиая кислота, инозит, пиридоксин и другие соединеня.
Из безазотистых минеральных солей на липидообразование наиболее сильное влияние оказывают фосфаты. Недостаток фосфора ведет к неполному использованию источников углерода, избыток меняет направление обменных процессов в сторону синтеза в клетке соединений нелипидной природы.

Расширение спектра микробных полисахаридов, имеющих практическое значение, обусловило успехи в области организации их производства. В настоящее время микробиологическая промышленность многих стран выпускает ряд ценных экзогликанов: декстран (СССР и другие страны), ксантан (США, Франция), пуллулан (Япония), склероглюкан или «политран» (США), занфло (США), курдлан (Япония). Уже решены или решаются вопросы внедрения в производство ряда других полисахаридов, детально изученных в лабораторных условиях, проверенных на практике и производимых в полупромышленном масштабе.
Производство различных полисахаридов не универсально. Для каждого гликана оно имеет свои особенности, определяемые физиологией продуцента, локализацией и физико-химическими свойствами полимера, областью его применения.
Получение экзополисахаридов имеет преимущества перед получением внутриклеточных, так как экзогликаны образуются, как правило, в значительно большем количестве, легче отделяются от биомассы и очищаются от примесей. Однако при производстве экзогликанов имеются свои технологические трудности. Накопление полисахарида в среде приводит к ограничению доступа кислорода к клеткам. У аэробных микроорганизмов это снижает энергетический баланс и тормозит синтез полисахарида. Повышенная вязкость среды делает невозможным отделение полисахарида от клеток продуцента из нативной культу-ральной жидкости. Ее приходится разбавлять в десятки раз, а после удаления клеток концентрировать до первоначального или меньшего объема. Решение этих проблем связано с дополнительными затратами.
Приведем основные этапы производства наиболее широко применяемых сейчас полисахаридов — декстрана и ксантана.
Плазмозаменители из декстранов выпускают под названиями: клинический декстран, полиглюкин, синкол, макродекс, плазмо-декс, хемодекс и др. Для получения декстранов используют штаммы Leuconostoc mesenteroldes. Ферментацию ведут на среде с 10—30% сахарозы, декстраном — «затравкой», дрожжевым экстрактом, минеральными солями. Создают условия, способствующие синтезу той формы декстрана, которая используется в качестве плазмозаменителя: линейного глюкана, имеющего более 90% а-1,6-связей, с молекулярной массой 60—80 тыс. Для этого ограничивают содержание в среде магния, стимулирующего синтез разветвленных декстранов, вносят «затравку» в виде декстрана, имеющего молекулярную массу 20—30 тыс. Такой акцептор обеспечивает преимущественное образование необходимого полимера.
Наивысшей биологической активностью обладают декстраны, содержащие менее 70% а-1,6-гликозидных связей, т. е. более разветвленные. Синтезу биологически активных декстранов способствует, кроме магния, замена сахарозы мелассой. Оптимальное значение рН для роста продуцента лежит в пределах 6,5—8,0, а для накопления декстрансахаразы — около 7,0. Обычно значение рН среды задают в интервале 7,0—8,0.
Бактерии расщепляют сахарозу на глюкозу и фруктозу. Фруктоза сбраживается по типу гетероферментативного молочнокислого брожения с образованием молочной и уксусной кислот, маннита и СОз. Глюкоза полимеризуется в декстран. Процесс идет быстро и продукт можно выделить уже через 24 ч.
Декстран выделяют из культуральной жидкости, например, метанолом. Можно, используя определенные приемы, осаждать фракции клинического декстрана с молекулярной массой 60—80 тыс. даже из смеси декстранов разной молекулярной массы. Можно осадить весь продукт, растворить его в воде и изолировать требуемый декстран фракционированием. При необходимости выделенный декстран деполимеризуют (ферментативно, термической обработкой или ультразвуком). Для очистки декстран неоднократно растворяют в воде, переосаждают метанолом и фракционируют.
Поскольку декстрансахараза в значительной степени выделяется в среду и синтез полимера идет вне клетки, декстраны получают и ферментативным путем. Для этого продуцент выра.-щивается в условиях, обеспечивающих наиболее высокую активность внеклеточного ферментного комплекса. В период максимальной активности декстрансахаразы культуральную жидкость отделяют от клеток и консервируют, снижая значение рН до 5,0—5,2. При такой кислотности и температуре около 15 °С декстрансахараза, содержащаяся в культуральной жидкости, сохраняет активность не менее месяца. В СССР разработана технология получения частично очищенной декстрансахаразы. Ферментационная среда должна содержать сахарозу и декстран-«затравку». Процесс синтеза продолжается около 8 ч. Ферментативный способ удобнее микробиологического, так как он поддается более надежному контролю и регулированию, позволяет одним только варьированием исходных концентраций сахарозы и фермента, а также температуры процесса сразу получать декстран необходимой молекулярной массы.

Источник углерода. Большинство микроорганизмов синтезирует полисахариды из всех источников углерода, обеспечивающих их рост: углеводов, спиртов, карбоновых кислот-, аминокислот, углеводородов, Сi-соединений. В настоящее время особое внимание привлекает возможность образования микроорганизмами полисахаридов на средах с углеводородами и ( -соединениями. На средах с «-алканами экзопо\лисахариды синтезируются многими представителями артробактерий и сапротроф-ных микобактерий, некоторыми коринебактериями, дрожжами рода Candida. Ряд метилотрофных бактерий образует значительные количества внеклеточных полисахаридов при росте на средах с метанолом. Methylococcus capsulatus образует полисаха-ридные капсулы и при использовании метана.
Помимо микроорганизмов, синтезирующих полисахариды на средах с любым источником углерода, допускающим рост, встречаются организмы, образующие гликаны лишь при использовании некоторых из них. Например, Leuconostoc mesenteroides может расти, потребляя различные углеводы, но синтезирует декстран только на средах с сахарозой.
Природа соединения углерода и его концентрация могут влиять на количественный выход полисахаридов. Так, наиболее высокий выход экзогликана в культурах некоторых микобактерий наблюдается в среде с гексадеканом, хотя биосинтез полимера возможен на средах с другими углеводородами, сахарами и многоатомными спиртами. В ряде случаев для максимального образования полисахарида требуется более высокая концентрация источника углерода в среде, чем для наивысшего накопления биомассы. В условиях периодического культивирования синтезу полисахаридов обычно благоприятствует создание избытка углерода в среде при некотором дефиците азота и фосфора. Однако стимуляция биосинтеза экзогликанов повышением содержания углеродного субстрата в среде возможна лишь до определенного предела, сверх которого положительный эффект не проявляется, а в некоторых случаях наблюдается угнетение процесса. При культивировании в хемостате некоторые микроорганизмы образуют внеклеточные гликаны даже при лимитации углеродным субстратом.
Моносахаридный состав гликанов микроорганизмов не меняется в зависимости от источника углерода, варьируют только состав и соотношение неуглеводных компонентов. Если же микроорганизм синтезирует более одного экзогликана, изменение углеродного субстрата часто ведет к преимущественному синтезу одного из полимеров. Например, соотношение аубазидана и пул-лулана в культуре A. pullulans сильно различается на средах с разными сахарами. Изменение концентрации источника углерода может регулировать скорость синтеза полисахаридов и их молекулярную массу.
Источник азота. Образование полисахаридов возможно, как правило, при использовании источников азота, способных поддерживать активный рост продуцента. Но природа источника азота может, не изменяя рост микроорганизма, влиять на количественный выход гликанов. Существуют микроорганизмы, для роста которых предпочтительнее один источник азота, а для биосинтеза полисахарида — другой. Повышенные концентрации азота в среде, как правило, отрицательно сказываются на синтезе полисахаридов. Качественный состав гликанов, по-видимому, не зависит от источников азота.
Другие компоненты среды. На биосинтез полисахаридов могут влиять и другие необходимые для роста микроорганизмов компоненты среды. Большое значение для образования гликанов имеет фосфор. Повышенное содержание фосфора в среде тормозит синтез многих полисахаридов. Но увеличение концентрации фосфора до определенных пределов способствует накоплению левана G. oxydans.
Важное значение имеют различные ионы, необходимые для поглощения субстрата или в качестве кофакторов биосинтеза полисахаридов. Катионы железа оказывают положительное действие на продукцию полисахаридов Pseudomonas aeruginosa и Methytotnonas mucosa, на выделение в среду левансахаразы G. oxydans. Ионы марганца необходимы для образования глю-кана Rhyzoblum japonicum и маннана Sacch. cerevisiae. Магний способствует синтезу разветвленных декстранов L. mesenteroides. Концентрация ионов кальция в среде определяет соотношение маннуроновой и гулуроновой кислот в экзополисахариде Л. vine-landii.
Образование гликанов, как правило, не требует дополнительных количеств витаминов сверх необходимого для нормального роста продуцента. Стимуляция биосинтеза полисахаридов витаминными добавками наблюдается только в отдельных случаях.