Промышленная микробиология

Способность образовывать лимонную кислоту при росте на средах с углеводами — свойство, широко распространенное среди мицелиальных грибов. Для получения лимонной кислоты в лабораторном и промышленном масштабе использовали грибы рода Aspergillus (в том числе виды A. awamori; A. clavatus, A. furna-ricas, A. japonicus, A. niger, A. wentii), рода Penicillium (в том числе P. chrysogenum, P. citrinum, P. citrogenutn, P. luteum), а также Botrytis cinerea, Paecilomyces divaricatum, Mucor piriformis, Polyporus anceps и некоторые другие.
В настоящее время в качестве продуцента лимонной кислоты применяются различные штаммы A. niger. Используемые в производстве штаммы отличаются большой скоростью роста, легкостью культивирования и высоким выходом лимонной кислоты.
До недавнего времени в производстве использовали специально селекционированные штаммы гриба, выделенные из природных источников. Последние, два десятилетия в качестве продуцентов все шире применяются экспериментально полученные му-тантные штаммы, отличающиеся от природных рядом положительных свойств, в первую очередь более высоким выходом целевого продукта.

Лимонная кислота образуется Л. niger (и другими грибами) в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) в результате конденсации оксалоацетата и ацетил-КоА, осуществляемой цитрат-синтазой.
Необходимые для реакции оксалоацетат и ацетил-КоА образуются из двух молекул пирувата: одна молекула пирувата подвергается декарбоксилированию с образованием ацетил-КоА, вторая — карбоксилируется, давая оксалоацетат. Пируват образуется по фруктозобисфосфатному пути (пути Эмбдена, Мейр-гофа — Парнаса). Все ферменты этого пути, а также пируватде-гидрогеназа, пируваткарбоксилаза и цитрат-синтаза обнаружены у A. niger. Полагают, что аконитат-гидратаза (аконитаза) и изоцитрат-дегидрогеназа, ответственные за метаболизм лимонной кислоты в ЦТК, хотя и присутствуют в клетках гриба в период синтеза этой кислоты, однако их активность ограничена дефицитом ионов металлов (Fe, Мп), низким значением рН среды, а также рядом образовавшихся метаболитов. Аконитат-гидратаза — железо-протеин: для ее активации необходим ион Fe2+, а ингибитором фермента является Н2О2, накапливающаяся в Fe-дефицитных клетках гриба. В отношении изоцитратдегидрогеназы установлено, что ферроцианид калия ингибирует этот фермент. В связи с этим становится понятным положительный эффект присутствия избытка данной соли в среде на процесс накопления кислоты. Другим ингибитором изоцитратдегидрогеназы служит лимонная кислота, накапливающаяся в клетках в высокой концентрации и угнетающая активность фермента.
Таким образом, представления в отношении причин сверхсинтеза грибами лимонной кислоты можно суммировать следующим образом. Лимонная кислота — обычный метаболит ЦТК и в небольшом количестве присутствует в клетках разных микроорганизмов. Некоторые грибы (в первую очередь Л. niger) способны синтезировать огромные количества этой кислоты. Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста грибов-продуцентов минеральными компонентами среды и одновременном избыточном содержании источника углерода.

При производстве лимонной кислоты применяются три способа ферментации: 1) культивирование продуцента на поверхности твердой питательной среды (твердофазная ферментация); 2) поверхностное культивирование на жидкой среде; 3) погруженное глубинное культивирование.
Культивирование на поверхности твердой среды. Гриб-продуцент {A. niger) выращивают в неглубоких лотках на поверхности влажных отрубей риса или пшеницы. Во время ферментации рН массы отрубей падает до 1,8—2,0. После окончания процесса лимонная кислота вместе с небольшим количеством одновременно образовавшихся глюконовой и щавелевой кислот экстрагируется водой, а затем осаждается в виде соли кальция. В связи с тем, что отруби богаты железом и другими микроэлементами, используют штаммы A. niger, не чувствительные к высоким концентрациям металлов Такой наиболее простой метод получения лимонной кислоты применяется только в Японии.
Поверхностное культивирование на жидкой среде. Метод поверхностного культивирования широко используется для производства лимонной кислоты в странах Европы и Америки. Поверхность жидкой среды, разлитой в неглубокие кюветы, засевают конидиями гриба-продуцента. Кюветы размещают на стеллажах в термостатированных «бродильных камерах». Гриб развивается в виде плотной пленки на поверхности питательной среды, содержащей высокие концентрации сахара. Образующаяся лимонная кислота переходит из клеток мицелия в раствор, из которого после окончания процесса ее осаждают в виде кальциевой соли, а затем переводят в форму свободной кислоты и кристаллизуют.
Получение посевного материала (спор гриба) проводят в споровом цехе. Такие цехи, имеющиеся только на некоторых заводах, обеспечивают посевным материалом все предприятия. Приготовление питательной среды и превращение сахара грибом в лимонную кислоту, а также последующее отделение мицелия осуществляется в «бродильном цехе». Выделение лимонной кислоты из «сброженных» растворов и получение ее в кристаллическом виде производят в химическом цехе.
В качестве продуцентов лимонной кислоты поверхностным методом на большинстве заводов нашей страны, а также на ряде фирм за рубежом используются мутантные штаммы A. niger (например, Р-1 и Р-3).
Производство посевного материала осуществляют в стерильных условиях следующим образом. Споры исходной музейной культуры высевают на поверхность агаризованной питательной среды, разлитой в алюминиевые кюветы площадью 10—12 дми, последние помещают в термостат. На поверхности среды формируется плотная пленка мицелия, которая затем покрывается конидиями. Через 10 сут пленки просматривают и отбраковывают .те из них, в которых обнаружено незрелое спороношение или инфекция. С поверхности мицелия споры собирают с помощью устройства, работающего по принципу пылесоса, споры просушивают в термокамере при 28—30 °С, смешивают со стерильным активированным углем в отношении 1:2, расфасовывают в стерильные колбы и банки емкостью 0,5—1,0 л, закрывают ватными пробками и сохраняют при комнатной температуре. Срок годности спор 6 мес. В таком виде посевной материал (споры) передается на заводы, производящие кислоту.
Выращивание гриба осуществляют в плоских кюветах (высота бортов до 20 см), расположенных одна над другой на стеллажах в «бродильной камере» (рис. 26.3). В зависимости от размера камеры в ней могут быть расположены два или более стеллажа. На каждом стеллаже размещается 8—10 кювет, расстояние между которыми (по вертикали) 30—40 см. Кюветы изготовляют из нержавеющей стали или чистого алюминия — материалов не подвергающихся коррозии и не загрязняющих среду ионами Fe. Заполнение кювет стерильной средой и слив из них сброженного раствора производится через штуцер в дне кюветы, соединенный шлангом с общим стояком, находящимся вне камеры. Камера оборудована системой приточно-вытяжной вентиляции, обеспечивающей подачу стерильного воздуха необходимой температуры и влажности. Воздух равномерно распределяется по всей камере.
Среду готовят в специальном отделении. В качестве источника углерода в нее вносят сахарозу. При организации первых производств лимонной кислоты сырьем служил кристаллический свекловичный сахар. В 50-е годы на заводах в нашей стране сахар был заменен на свекловичную мелассу (отход сахарного производства). Меласса содержит от 43 до 49% сахарозы, отличается сложностью и непостоянством химического состава. Она содержит большое количество микроэлементов, в первую очередь железо, угнетающее образование кислоты грибом. Поэтому" перед введением в среду мелассу необходимо освободить от ионов металлов. В США мелассу освобождают от металлов с помощью катионообменных смол. В СССР обычно применяется обработка мелассы желтой кровяной солью (KiFe(CN)6) с последующим кипячением раствора. В результате соли железа и других тяжелых металлов осаждаются и их удаляют из раствора сахара.
Подготовленные стерильные кюветы заполняют стерилизованной средой (высота слоя жидкости 12 см) и засевают спорами гриба. Конидии, нанесенные на поверхность питательного- раствора, прорастают, образуется мицелий гриба и прочная пленка, покрывающая всю поверхность раствора. Максимальная интенсивность роста мицелия наблюдается примерно на 4-е сух, что сопровождается активным тепловыделением и образованием СОг. В процессе ферментации происходит постепенное нарастание общей кислотности. Начальное значение рН среды 6,8—7,0 снижается в течение первых трех суток до 4,5, а к концу процесса до 3,0.

Способность различных грибов, в том числе A. niger, продуцировать лимонную кислоту проявляется в строго определенных условиях культивирования. Как правило, культуры грибов при избытке питательных веществ не накапливают лимонной кислоты, а образуют значительную биомассу и окисляют сахар до СОг и Н20. Синтез лимонной кислоты грибом-продуцентом осуществляется обычно на средах с высокой концентрацией углевода (5—20%). Наилучшим субстратом для A. niger является сахароза.
Накопление кислоты имеет место при ограничении роста гриба одним из минеральных компонентов среды (Fe, Mn, P, N) или несколькими компонентами одновременно. Преимущественное образование лимонной кислоты происходит при культивировании продуцента при низком значении рН среды. В таких условиях синтез других органических кислот подавляется. Процесс кислотообразования осуществляется в условиях достаточного обеспечения культуры молекулярным кислородом.
В процессе ферментации, как принято называть микробиологические производства, можно выделить две фазы (рис. 26.2): 1) активного роста гриба и 2) интенсивного кислотообразования, рост мицелия в этот период становится незначительным.

Способность образовывать лимонную кислоту при росте на средах с углеводами — свойство, широко распространенное среди мицелиальных грибов. Для получения лимонной кислоты в лабораторном и промышленном масштабе использовали грибы рода Aspergillus (в том числе виды A. awamori; A. clavatus, A. furna-ricas, A. japonicus, A. niger, A. wentii), рода Penicillium (в том числе P. chrysogenum, P. citrinum, P. citrogenutn, P. luteum), а также Botrytis cinerea, Paecilomyces divaricatum, Mucor piriformis, Polyporus anceps и некоторые другие.
В настоящее время в качестве продуцента лимонной кислоты применяются различные штаммы A. niger. Используемые в производстве штаммы отличаются большой скоростью роста, легкостью культивирования и высоким выходом лимонной кислоты.
До недавнего времени в производстве использовали специально селекционированные штаммы гриба, выделенные из природных источников. Последние, два десятилетия в качестве продуцентов все шире применяются экспериментально полученные му-тантные штаммы, отличающиеся от природных рядом положительных свойств, в первую очередь более высоким выходом целевого продукта.

Лимонная кислота — трехосновная оксикислота, широко распространена в природе, относительно много ее содержится в некоторых ягодах, фруктах, особенно в цитрусовых (в лимоне 5—8%), в листьях и стеблях некоторых растений.
Лимонную кислоту выделяют в виде лимоннокислого кальция из продуктов переработки листьев хлопчатника, стеблей махорки, хвои ели, плодов лимонов.
В Италии и Испании еще существует производство лимонной кислоты, основанное на осаждении цитрата кальция из сока лимонов. До 1930 г. Италия была основным поставщиком цитрата кальция в мире. В настоящее время лимонную кислоту производят во всех промышленно развитых странах методом микробиологического синтеза, мировая продукция кислоты составляет около 300 тыс. т в год.
Лимонная кислота благодаря своим вкусовым качествам и физико-химическим свойствам широко применяется в ряде отраслей пищевой промышленности: кондитерской (конфеты, желе), винодельческой, безалкогольных напитков, консервной, пищеконцентратов. Она используется в фармацевтической промышленности, в том числе при переливании крови, а также при приготовлении косметических средств. Лимонная кислота — прекрасный хелатирующий (комплексообразующий) агент, что позволяет широко использовать ее в процессах электрогальванизации, дубления кож, окраски тканей, приготовления чернил, очистки паровых котлов, изготовления синтетических моющих средств. Используется лимонная кислота в химической промышленности, в том числе при производстве алкидных смол, а ее эфиры служат пластификаторами при производстве лаков.

В 1891 г. немецкий ученый Вемер установил способность плесневых грибов продуцировать органические кислоты. При выращивании A. nlger на среде с сахаром им было констатировано выделение щавелевой кислоты. Через два года Вемер обнаружил лимонную кислоту, накапливающуюся в среде- при выращивании грибов, названных им Citromyces (С. pfefferianus и С. glaber). Впоследствии Citromyces были отнесены к роду Peniclllium. Вемер пытался осуществить производство лимонной кислоты с помощью гриба из сахара. Работа окончилась неудачей в связи с рядом трудностей, непреодолимых в то время.
В 1917 г. американский ученый Кэрри сообщил о способности ряда штаммов A. niger продуцировать лимонную кислоту наряду с щавелевой. Это было важное открытие, поскольку в отличие от плохо растущих пенициллов Л. niger характеризовался мощным и быстрым ростом. Штамм -гриба, с которым работал Кэрри, и условия ведения процесса были в дальнейшем использованы американской фирмой Пфайзер для организации в 1923 г. первого микробиологического процесса производства лимонной кислоты.
Работы Вемера и Кэрри вызвали большой интерес к изучению некоторых грибов и в первую очередь продукции ими органических кислот. В этом плане развернулись широкие исследования в различных странах, в том числе СССР, Англии, Чехословакии, США и Японии. В Советском Союзе работы по изучению физиологии и биохимии грибов и продукции ими органических кислот проводились в лабораториях В. С. Буткевича в Москве и С. П. Костычева в Ленинграде. Буткевичем было сделано принципиально важное открытие. Он показал, что, изменяя условия культивирования грибов, можно изменить их биохимическую активность и получить разные продукты. Так, при культивировании A. niger в присутствии СаС03 при рН среды, близком к 7,0, происходило преимущественное накопление глюконовой и щавелевой кислот, а в условиях высокой кислотности среды без СаСОз образовывалась практически одна лимонная кислота. Этот факт, впоследствии подтвержденный Костычевым, оказался принципиально важным для организации промышленного производства лимонной и глюконовой кислот не только в нашей стране, но и за рубежом.
Заслуга Бут.кевича состояла также в том, что он первый дал бесспорное доказательство образования лимонной кислоты из сахара. Благодаря работам Буткевича, Костычева, а также их учеников в Советском Союзе в начале 30-х годов было создано микробиологическое производство лимонной кислоты с помощью A. niger. В 1935 г. в Ленинграде был пущен первый в стране специализированный завод, производящий лимонную кислоту.
К началу 30-х годов производство лимонной кислоты «биохимическим» способом было организовано также в Бельгии, Чехословакии, Франции, а затем и в других странах.

Пиво — слабоалкогольный напиток — получают путем сбраживания охмеленного сусла специальными расами дрожжей. Вкус и аромат его создают экстрактивные вещества, извлеченные из солода, горькие и ароматические вещества хмеля, а также этиловый спирт, углекислый газ и другие продукты брожения. Сортовые различия пива определяются типом используемого солода, количеством и видом добавляемых неосоложенных продуктов. Процесс производства пива включает ряд стадий: изготовление солода из ячменя, получение охмеленного сусла, сбраживание сусла, дображивание и созревание молодого пива, фильтрацию и розлив.
Пивные дрожжи, используемые в пивоваренной промышленности, обладают высокой флокуляционной способностью, медленно и полно оседают при осветлении молодого пива в конце главного брожения и готового — в конце дображивания. Они активно сбраживают глюкозу и фруктозу, медленнее — мальтозу и еще медленнее — трисахарид мальтотриозу. Декстрины не сбраживаются и играют важную роль в создании полноты и вкуса пива. Пивные дрожжи в незначительном количестве накапливают высшие спирты, диацетил и сернистые соединения, а также обеспечивают насыщенность пива углекислотой. В настоящее время в СССР в пивоваренной промышленности применяют главным, образом дрожжи Sacch. cerevisiae низового брожения (наиболее широко используют расы 776, 41, 44, S-Львовская, 11, 8а(М), а также расы Р и F).
При производстве пива могут развиваться посторонние виды дрожжей. Они ухудшают процесс брожения и осветления пива, вызывают его помутнение, придают посторонний вкус и запах. Описано около 30 видов «диких дрожжей», инфицирующих пиво. Однако детальное Изучение свойств многих из них показало, что многочисленные «виды» в большинстве случаев являются мутантами культурных дрожжей. В настоящее время предложено рассматривать такие «виды» как синонимы Sacch. cerevisiae.

Существенную роль в создании вкуса и аромата хлеба, особенно ржаного, а также его усвояемости играют различные виды гомо- и гетероферментативных молочнокислых бактерий. В результате сбраживания Сахаров в тесте они образуют углекислый газ, молочную и уксусную кислоты, а также этиловый спирт. Гомо- и гетероферментативные лактобациллы осуществляют, кроме того, протеолиз белков муки, способствуя накоплению в заквасках и тесте азотсодержащих водорастворимых веществ, играющих определенную роль и в создании аромата хлеба. Образуемые молочнокислыми бактериями кислоты, не влияя на дрожжи, подавляют гнилостные, маслянокис-лые, уксуснокислые бактерии и представителей энтеробактерий.
В практике хлебопечения издавна используют способствующие поднятию теста закваски, включающие штаммы гомо- и гетероферментативных молочнокислых бактерий.

Молочнокислые бактерии находятся в мясных продуктах, как прошедших термическую обработку, так и охлажденных. Посолочные ингредиенты, в частности поваренная соль, не подавляют рост тех из них, которые обладают устойчивостью к высокой концентрации соли (16—24 %-NaCl).
Важна роль молочнокислых бактерий при приготовлении сырокопченых («ферментативных») колбас. Они придают им специфический букет, резко подавляют рост гнилостных микроорганизмов, оказывают благоприятное влияние на консистенцию, связанность и цвет фарша. Количество молочнокислых бактерий возрастает во время созревания колбас. В хорошо высушенной колбасе содержатся почти исключительно лактобациллы. В свиных копченых мясных продуктах (бекон, окорок, грудинка, корейка) после посола также преобладают молочнокислые бактерии; большое число их обнаружено в заливочных рассолах, используемых для сокращенных и длительных посолов окороков.
Селекционированы штаммы педиококков, стрептококков и лактобацилл, применяемые как компоненты заквасок для сухих и сырокопченых колбас. Бактериальная закваска (5. laciis и L. plantarum) рекомендована к применению при посолке окороков.
Молочнокислые бактерии играют роль в созревании посоленной рыбы. Сельдевые после посола в процессе хранения приобретают новый «букет» и новые вкусовые качества, очевидно, благодаря развитию гетероферментативных ароматообразующих кокков. Leuc. те s enter oldes, L, plantarum, Pediococcus sp. используют для приготовления национального блюда жителей Филиппин, включающего мясо, рыбу, а также рис. Микробиологические процессы в рыбных силосах (измельченная рыба, солодовая и зерновая мука) близки к процессам, протекающим в силосах из зеленых кормов.